研究者筛选得到了两株靶向EBV gB蛋白的中和抗体3A3和3A5，并验证了其体内保护效果，通过以双荧光素酶报告系统为基础的细胞融合模型探究了3A3及3A5阻断膜融合的能力及其中和机制。

（2022年8月发表）

文章题目：Protective anti-gB neutralizing antibodies targeting two vulnerable sites for EBV-cell membrane fusion

发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (PNAS)

发表日期：2022

关键词：Epstein–Barr virus；glycoprotein B；neutralizing antibody；viral membrane fusion；

lymphoproliferative disorder

作者及单位：重庆医科大学张晓副教授、厦门大学洪俊平博士、中山大学肿瘤防治中心钟玲博士等为本文的共同第一作者。中山大学肿瘤防治中心徐淼教授、厦门大学夏宁邵教授、厦门大学陈毅歆教授等为本文的共同通讯作者。

文章亮点

● 靶向gB的两株中和抗体3A3、3A5能够在体外及体内高效中和EBV感染；

● 3A3结合在gB 中部的第II结构域，3A5与gB头部的第IV结构域结合，两个表位均为新鉴定表位；

● 3A3及3A5识别的表位是免疫优势表位；

● 3A3及3A5通过不同的机制抑制膜融合过程

实验设计

首先用重组gB蛋白免疫新西兰大白兔，利用B细胞单克隆分选技术筛选得到具有高结合能力和高中和能力的两株兔源单克隆抗体3A3和3A5；

随后通过体内、体外模型验证这两株抗体的中和活性，利用Cryo-EM解析抗原-抗体复合物结构并鉴定抗体识别表位；

进而通过与EB病毒健康携带者及鼻咽癌患者的血清进行竞争实验，说明3A3及3A5识别的表位在自然感染人群体内诱导抗体产生的优势性；

最后通过膜融合试验（如下图所示）研究抗体抑制膜融合能力及其表位在膜融合过程中发挥的作用，并借助细胞结合实验等生化方法进一步阐释3A3和3A5的中和机制。

主要实验方法

1.B细胞单克隆分选技术筛选抗体

用gB蛋白免疫新西兰大白兔后，采集约5毫升血液，分离、收集外周血单核细胞（PBMCs）。将PBMCs用PBS重悬，加入生物素标记的gB蛋白，在4℃下孵育30分钟，PBS洗涤三次，800 × g离心5分钟。而后利用LIVE/DEAD Aqua，mouse anti-rabbit CD4: FITC，mouse anti-rabbit CD8: FITC，mouse anti-rabbit T lymphocytes: FITC，mouse anti-rabbit IgM: RPE以及streptavidin APC conjugate进行染色，而后使用BD FACS Aria III细胞分选仪进行B细胞分选。将抗原阳性的B细胞分选到96孔板中，体外培养7天，收集上清进行ELISA检测。最后，提取阳性B细胞的RNA，反转录cDNA，采用巢式PCR钓取抗体重链和轻链可变区，将PCR产物插入含有兔重链或轻链恒定区的载体中，利用293F细胞表达重组抗体。

2. 膜融合试验

● 抗体抑制膜融合能力鉴定

效应细胞：HEK-293T达到80%汇合度时，转染2.5 μg pCAGGS-gB、pCAGGS-gH、pCAGGS-gL和pCAGGS-T7（表达T7 DNA聚合酶）。受体细胞：HEK-293T细胞转染10 μg pT7EMCLuc（在T7启动子控制下表达荧光素酶报告基因）。转染24小时后，将2 × 105效应细胞消化，加入20 μg 3A3、3A5、3A3+3A5和1E12在37℃下孵育30分钟。然后，将该抗体-效应细胞混合物与2 × 105受体细胞在24孔板中混合共培养24小时。按照Dual-Glo® Luciferase assay system (Promega)的说明，裂解共培养的细胞，定量荧光素酶活性。

● 抗体识别的表位在膜融合中的作用探究

效应细胞：HEK-293T达到80%汇合度时，转染2.5 μg pCAGGS-gB突变体、pCAGGS-gH、pCAGGS-gL和pCAGGS-T7（表达T7 DNA聚合酶）。受体细胞：HEK-293T细胞转染10 μg pT7EMCLuc(在T7启动子控制下表达荧光素酶报告基因)。转染24小时后，将2 × 105效应细胞与2 × 105受体细胞在24孔板中混合共培养24小时。按照Dual-Glo® Luciferase assay system (Promega)的说明，裂解共培养的细胞，定量荧光素酶活性。

主要实验试剂

产品                                                        规格                 目录号

Dual-Glo® Luciferase assay system            100 ml             E2940

主要结果展示

一、3A3、3A5在体外可以中和EBV感染并显著抑制膜融合

两株抗体均可有效中和上皮和B细胞感染，此外也能够有效抑制膜融合过程。另外，在细胞感染阻断模型中联合使用3A3和3A5显示出较强的协同效应。

二、3A3及3A5通过不同的机制抑制EBV感染

在细胞膜融合模型中，3A3关键位点突变蛋白不影响gB的膜融合功能，而3A5的关键位点突变均可抑制gB的膜融合功能，说明3A5所识别的表位对于gB在膜融合过程当中的变构至关重要，3A5可能通过阻碍gB变构而发挥中和功能。而3A3的表位与gB辅助受体NRP1的结合表位重叠，3A3所识别关键位点突变后，gB不能与NRP1结合，说明3A3可能通过阻断gB与受体的结合而发挥中和效果。

参考建议

1、双荧光素酶报告基因受多种因素影响，特别是要保证细胞状态和转染效率等；

2、孔与孔之间读值差别较大，建议实验一般需要做3个或3个以上复孔;

3、裂解过程尽量在冰浴中进行；

4、样品发光值应该远大于背景值，一般至少在10万的读值以上。